Клоттоциты: искусственные механические тромбоциты

Автор: Robert A. Freitas Jr., ведущий исследователь IMM

        Часто задают вопросы о тех уникальных возможностях, которые принесет в нашу жизнь наномедицина. То есть, может ли наномедицина на базе простых нанороботов выполнять такие операции, которые невозможны в принципе даже с помощью развитой биотехнологии? Респироциты [1] – искусственные красные кровяные клетки – представляют собой один из ответов на этот вопрос. Респироцит – это пневмогидроаккамулятор из алмазоида, размерами около одного микрона, предназначенный для переноса респираторных газов внутри человеческого тела, который, в зависимости от потребности тканей, может то нагнетать газы под давлением в 1000 атмосфер, то выпускать их в окружающую среду.

        В данной статье рассматривается функциональное описание еще одной составной части механизированной крови – искусственных тромбоцитов, выполненных с помощью нанотехнологий. Эти устройства могут обеспечить уникальную возможность – «быстродействующий гемостазис».

        Структура и основные функции тромбоцитов хорошо известны. Тромбоцит это сфероидальная безъядерная клетка крови диаметром ~ 2 мкм с продолжительностью жизни в среднем 10 дней [2]. В здоровой человеческой крови концентрация тромбоцитов составляет ~ 250000 клеток на мм3 [3]. Попадая в место кровотечения тромбоциты активируются, слипаются в комок и закупоривают кровеносный сосуд, останавливая кровотечение. Интересно, что было найдено несколько необычных способностей тромбоцитов – они способны к фагоцитозу как микропаразитов [5] как и посторонних частиц вообще [6], могут медленно передвигаться по стенкам кровеносных сосудов, вытягивая ложноножки [4].

        Полный функциональный дизайн искусственных тромбоцитов выходит за рамки данной статьи. Далее остановимся на чисто механических аспектах работы искусственного тромбогенеза, осветив вопрос,сколько нужно наномеханических устройств для обеспечения гемостазиса in vivo.

        Активация тромбоцитов – первичный гемостазис обычно протекает в трех фазах [13]. Первая фаза представляет собой адгезию тромбоцитов, в которой тромбоциты близко приближаются друг к другу.

        Вторая фаза подразумевает расположение фибрина в месте кровотечения. Фибрин быстро формирует плотный «комок» из большого сплетения фибрилл благодаря взаимодействию фибриногена с гликопротеиновыми рецепторами на поверхности тромбоцита (комплекс gpIIb/IIIa) в присутствии нескольких микромолей кальция. В эту «паутину» и попадают эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. 

        Третья фаза – секреция тромбоцитов, в которой тромбоцит опорожняет содержимое своих внутриклеточных капсул в межклеточное пространство. Эта операция подразумевает наличие аденозинодифосфата (АДФ), Ca⁺⁺, и различные белки, например фактор 4 и тромбоглобулин, благодаря которым формируется плотный тромб.

        Вторичный гемостазис протекает после формирования тромба. Фибриллы формируют плотную сеть, в которую попадают другие тромбоциты, образуя тромб еще больших размеров. 

        Полное время кровотечения варьируется от 2-5 минут [7-9] до 9-10 [10, 13] минут. Клинический риск составляет кровотечение, продолжающееся более 15-20 минут [11-13]. Медицинская литература дает среднее время коагуляции 6-17 минут [14]. (Время кровотечения увеличивается при падении количества тромбоцитов менее ~50,000 клеток/мм³ [12], что составляет ~20% нормального их количества). Через несколько часов фибриллы медленно заполняют весь объем тромба, наподобие спагетти в кипящей воде, формируя друг с другом нестабильные мономеры до тех пор, пока они не будут полностью связаны ковалентными дисульфидными связями с фактором XIIIа, образуя плотный тромб. 

        Искусственный тромбоцит, или клоттоцит, например, может обеспечить полный гемостазис в течение 1 секунды, даже при наличии обширных кровотечений. Это примерно в 100-1000 раз быстрее, чем скорость нормального человеческого гемостазиса. Клоттоцит представляет собой наноробота сферической формы (диаметром около 2 – 4 микрон) на протеиновой основе с оксиглюкозным источником энергии. Внутри клоттоцита содержится компактно свернутая волоконная масса. Согласно команды от бортового компьютера, устройство выталкивает волокна в непосредственной близости от места кровотечения, например, поврежденного капилляра. Отдельные части волокон, контактируя с водой, находящейся в кровяной плазме (комплементарной антигенам, присущим поверхностям эритроцитов), растворяются в ней, раскрываясь подобно рыболовной сети. Красные кровяные клетки попадают в искусственную сеть, образованную все большим и большим числом активирующихся клоттоцитов, и кровотечение останавливается.

        Как много искусственных сетей может нести один клоттоцит? Требуемый объем нитей, покрывающий площадь А_сет, используя волокна с рабочей прочностью сигма_{воллокна} и толщину t_{волокна} с размером ячейки l_ячейки будет определяться выражением:

        Минимальная толщина волокна определяется как:

        где Ркрови – максимальное давление крови, ограничиваемое сетью, равное Ркрови~0.25 атмосфер, или 190 мм. рт. ст.

        Принимая L_ячейки ~1 микрон и сигмаволокна ~ 1010 Н/м² (для сети из алмазоида), t_{волокна} >~ 0.8 нм, получим для сети площадью Асет=0.1 мм² объем Vсети = 0.1 мкм³. Этот объем займет примерно 3% всего устройства. Используя вместо алмазоидных нитей биорастворимые органические нити на основе целлюлозы или шелка паука (сигма_{волокна} = 109 Н/м² [3]), получим, соответственно, что эти нити должны быть 2.5 нм толщиной и объем сети возрастет на 130%, занимая теперь 30% всего устройства (расчеты велись исходя из той же площади сети). Количество энергии в секунду, необходимой для выброса сети в плазму, рассчитанное на основе закона Стокса для жидкостей, составит 100 пВт в сек, принимая вязкость крови при нормальном 45% гематокрите.

        Как много клоттоцитов необходимо для остановки кровотечения за t_стоп=1 секунду? Их количество зависит от скорости капиллярного кровотечения v_кап. Пусть n_клотт – объемная концентрация роботов, необходимых для этого, n_сетей – количество слоев, образованных перекрытыми друг другом сетями. Тогда n_клотт ~ n_сетей/( А_сетt_стоп v_кап). Принимая n_сетей = 2 и v_кап = 1 мм/сек [3] получим n_клотт = 20 мм-3 или 110 миллионов клоттоцитов во всем объеме человеческой крови. Полностью раскрытые сети покроют площадь 11 м².

        Приведем некоторые интересные цифры. При ране длиной 1 см и глубиной 3 мм потеря крови составит ~ 6 мм³, что составляет 1/10 одной кровяной капли! То есть участок однослойной сети площадью в 1мм² пропустит 1-2 эритроцита.

        Например, атмосферная концентрация газов (СО2 и О2) отличается от их концентрации в кровяной плазме. Как только кровь, содержащая клоттоцитов, попадает на участок, где кровеносный сосуд порван, изменение парциального давления газов, измеряемое с помощью бортовых сенсоров наноустройства, даст ему знать, что он находится за пределами тела человека. Концентрация нанороботов в крови порядка 20 мм^-3, означает, что нанороботы будут разделены дистанцией в 370 микрон. 
Если первое устройство будет выброшено кровью из тела на расстояние 75 мкм от границы раздела кровяной плазмы и атмосферы, то молекулы кислорода, находящиеся в воздухе, могут диффундировать через плазму (при нормальной температуре человеческого тела 310 К) от границы плазмы до поверхности наноустройства приблизительно за одну секунду [3]. Клоттоциты, использующие акустические импульсы, могут быстро обнаружить это изменение, это происходит за считанные микросекунды благодаря возможности быстрого распространения акустических волн. Обычно температура воздуха ниже температуры тела. Время наступления теплового равновесия через расстояние L в плазме крови 310 K равняется t_EQ ~(6.7 x 10⁶) L², следовательно, при L = 75мкм, клоттоцит может обнаружить изменение температуры через t_EQ ~ 40 милисекунд. Также важны и другие параметры, которые можно детектировать с помощью сенсоров: кровяное давление, биоакустические параметры плазмы, биоэлектрические параметры плазмы; детектирование ультрафиолетовой радиации, сдвиги в величине pH и др. За счет уменьшения скорости реагирования, клоттоциты могут также взаимодействовать с естественными сигналами от натуральных тромбоцитов [3], используя сенсоры простагландина (сигнального фермента тромбоцитов, активирующего или ингибирующего их деятельность).

        Как клоттоцит будет определять, когда следует выбрасывать связывающую сеть? Для этого у него будут встроенные сенсоры парциального давления газов. Как только первый клоттоцит будет выброшен кровотоком из раны на поверхность человеческого тела, сенсоры немедленно сообщат бортовому компьютеру о изменениях в парциальных давлениях газов и устройство передаст эту информацию соседям при помощи акустических импульсов. Остальные же роботы, при получении этой информации, немедленно активизируют сети. Предполагаемый вид клоттоцита представлен на рис. 1 а, б.

 

Рис. 1 а Общий вид клоттоцита (взято из Наномедицинской Галереи Института Предвиденья)

адрес источника: Image #211, автор: Tim Fonseca

рис 1 б. Клоттоциты в действии (взято из Наномедицинской Галереи Института Предвиденья)

адрес источника: Image #212, автор: Tim Fonseca

        Как и любая техника, клоттоцит тоже может отказать. Так, например, механизм цепной реакции выброса сетей клоттоцитов может спровоцировать лавинообразное срабатывание механизмов по всему телу, вызывая моментальную коагуляцию крови, так называемую глобальную внутрисосудистую коагуляцию (ГВК) [18]. Но ГВК может быть инициирован не только искусственно. Известны разнообразные болезни, при которых концентрация тромбина в крови нарастает и кровь сворачивается. Нанороботы должны предупреждать возникновение ГВК, обусловленное и естественными факторами. В человеческом кровотоке ГВК ингибируется как местной локализацией (наличие фермента тромбина только возле места кровотечения), так и соответствующими ферментами (антитромбин III – потенциальный ингибитор). Клоттоциты же должны быть обеспечены сенсорами для обнаружения возрастающего уровня тромбина, фибриногена, плазминогена, альфа2 – антиплазмина, антитромбина III, фактора VII [19] и протеина С для устранения ГВК. Если условия ГВК нарастают, нанороботы будут активно поглощать тромбин, либо использовать один из его ингибиторов.

        При внешних ранениях в кровоток часто попадают инородные объекты, такие как бактерии, твердые частицы и т.п. Останавливая кровотечение, клоттоциты, видимо, должны выполнять функцию очистителей, что подразумевает усложнение их программы и конструкции. Возможно так же привлечение с помощью акустических сигналов [3] других видов нанороботов (напр. нанофагоцитов) для эффективной очистки крови от внешнего вторжения, что подразумевает наличие протоколов навигационной системы in vivo [3]. 

        Будут ли клоттоциты действительно инертны по отношению к кровеносной системе? Будут ли они совместимы с ней? Будут ли они взаимодействовать с клетками крови? Ответы на эти вопросы даст только более подробная их разработка. Действительно, используя в качестве внешней оболочки клоттоцитов белки, содержащиеся в мембранах эритроцитов или других клеток, роботы не будут подвергаться атакам фагоцитов и гранулоцитов. Сети роботов должны быть также неиммунногенны и полностью растворяться энзимами фагоцитов, когда кровотечение будет остановлено. Рассмотренная конструкция, выполненная из алмазоида, будет биологически инертна [15, 16]. Также алмазоид характеризуется не воспалительными свойствами [17]. Разработка материалов для нитей требует дальнейших изысканий, т.к они не должны вызывать ответа иммунной системы человека [19]. Эти и другие вопросы будут освещены после выхода второй части «Наномедицины».

        Итак, обобщая, клоттоциты способны остановить кровотечение в 100-1000 раз быстрее, чем это может исполнить естественный человеческий гемостазис. Даже если от 1 до 300 искусственных тромбоцитов не могут сработать и вызвать «цепную гемостатическую реакцию», то один функционирующий наноробот может передать это соседним, работающим нанороботам. Концентрация клоттоцитов для полного воспроизведения гемостазиса тромбоцитов необходима в размере всего ~0.01% от концентрации естественных клеток. Поэтому клоттоциты будут в ~10,000 раз более эффективны, чем естественные тромбоциты.

        Логично, что этот тип нанороботов будет использоваться совместно с другими, нами рассмотренными. В целом все типы нанороботов составят общую искусственную кровеносную систему.

Благодарности 

        Автор выражает благодарность Stephen S. Flitman, M.D., C. Christopher Hook, M.D., и Ronald G. Landes, M.D., за полезные комментарии к ранним версиям этой статьи. 

Ссылки 

1. Robert A. Freitas Jr., "Exploratory Design in Medical Nanotechnology: A Mechanical Artificial Red Cell," Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobil. Biotech. 26(1998):411-430. Смотри также: http://www.foresight.org/Nanomedicine/Respirocytes.html. 

2. J. Willis Hurst, Medicine for the Practicing Physician, Third Edition, Butterworth-Heinemann, Boston MA, 1992, p. 771. 

3. Robert A. Freitas Jr., Nanomedicine, Volume I: Basic Capabilities, Landes Bioscience, Georgetown, TX, 1999; see at: http://www.nanomedicine.com/. 

4. Etsuko Ito, Ken Suzuki, Masayuki Yamato, Masayuki Yokoyama, Yasuhisa Sakurai, Teruo Okano, "Active platelet movements on hydrophobic/hydrophilic microdomain-structured surfaces," J. Biomed. Mater. Res. 42(October 1998):148-155. 

5. R.P. Awadhiya, J.L. Vegad, G.N. Kolte, "Demonstration of the phagocytic activity of chicken thrombocytes using colloidal carbon," Res. Vet. Sci. 29(July 1980):120-122; B.S. Dhodapkar, J.L. Vegad, G.N. Kolte, "Demonstration of the phagocytic activity of chicken basophils in the reversed Arthus reaction using colloidal carbon," Res. Vet. Sci. 33(November 1982):377-379. 

6. A. Haque, W. Cuna, B. Bonnel, A. Capron, M. Joseph, "Platelet mediated killing of larvae from different filarial species in the presence of Dipetalonema viteae stimulated IgE antibodies," Parasite Immunol. 7(September 1985):517-526. 

7. R. Kumar, J.E. Ansell, R.T. Canoso, D. Deykin, "Clinical trial of a new bleeding-time device," Am. J. Clin. Pathol. 70(October 1978):642-645. 

8. HealthGate Medical Tests, "Bleeding Time," 27 July 1999, see at: http://www3.healthgate.com/mdx-books/tests/test35.asp. 

9. L. Ardekian, R. Gaspar, M. Peled, B. Brener, D. Laufer, "Does low-dose aspirin therapy complicate oral surgical procedures?" J. Am. Dent. Assoc. 131(March 2000):331-335. 

10. L.R. Hertzendorf, L. Stehling, A.S. Kurec, F.R. Davey, "Comparison of bleeding times performed on the arm and the leg," Am. J. Clin. Pathol. 87(March 1987):393-396. 

11. A. Barber, D. Green, T. Galluzzo, C.H. Ts'ao, "The bleeding time as a preoperative screening test," Am. J. Med. 78(May 1985):761-764. 

12. Franklin A. Bontempo, "Use and Misuse of the Bleeding Time," April 1994, see at: http://www.itxm.org/Archive/tmu4-94.htm. 

13. Stuart E. Lind, "Chapter 33. The Hemostatic System," in Robert I. Handin, Thomas P. Stossel, Samuel E. Lux, eds., Blood: Principles and Practice of Hematology, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, 1995, pp. 949-972. 

14. Clayton L. Thomas, ed., Taber's Cyclopedic Medical Dictionary, 17th Edition, F.A. Davis Company, Philadelphia PA, 1989. 

15. R. Kornu, W.J. Maloney, M.A. Kelly, R.L. Smith, "Osteoblast adhesion to orthopaedic implant alloys: effects of cell adhesion molecules and diamond-like carbon coating," J. Orthop. Res. 14(November 1996):871-877. 

16. R. Lappalainen, A. Anttila, H. Heinonen, "Diamond coated total hip replacements," Clin. Orthop. 352(July 1998):118-127. 

17. M. Doherty, J.T. Whicher, P.A. Dieppe, "Activation of the alternative pathway of complement by monosodium urate monohydrate crystals and other inflammatory particles," Ann. Rheum. Dis. 42(June 1983):285-291. 

18. R.L. Bick, B. Arun, E.P. Frenkel, "Disseminated intravascular coagulation. Clinical and pathophysiological mechanisms and manifestations," Haemostasis 29(1999):111-134; M. Levi, E. de Jonge, T. van der Poll, H. ten Cate, "Disseminated intravascular coagulation," Thromb. Haemost.

  82(August 1999):695-705; 706-721 (related). 

19. T.E. Warkentin, "Heparin-induced thrombocytopenia: a ten-year retrospective," Annu. Rev. Med. 50(1999):129-147; D.B. Brieger, K.H. Mak, K. Kottke-Marchant, E.J. Topol, "Heparin-induced thrombocytopenia," J. Am. Coll. Cardiol. 31(June 1998):1449-1459.